khoa luan tot nghiep,duoc si,nghien cuu,phoi hop,bromelain va a- chymotrypsin,voi ti le thich hop,ve hoat do enzym,va do ben hoat tinh,de lam thuoc,nguyen ich tuan
NGHIÊN CỨU PHỐI HỢP BROMELAIN VÀ a- CHYMOTRYPSIN VỚI TỈ LỆ THÍCH HỢP VỂ HOẠT ĐỘ ENZYM VÀ ĐỘ BỂN HOẠT TÍNH ĐỂ LÀM THUỐC
PHẨN 1: TỔNG QUAN
- Đại cương chung về protease
— Protease là các enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid trong phân tử và các cơ chất tương tự.
— Nhiều protease có khả năng thuỷ phân liên kết ester và vận chuyển acid amin.
— Phân loai quốc tế protease được chia làm 4 phân nhóm phụ:
+ Phân nhóm phụ 3.4.1: Gồm các aminopeptid do hydrolase (aminopeptidase) Xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid.
+ Phân nhóm 3.4.2: Gồm các enzym peptidil aminoacid hydrolase (cacboxylpeptitdase) Xúc tác cho sự thuỷ phân liên kết ở đầu mạch c của polypeptid.
+ Phân nhóm phụ 3.4.3: Gồm các enzym dipeptid - hydrolase xúc tác cho sự thuỷ phân dipeptid.
+ Phân nhóm phụ 3.4.4: Gồm các enzym dipeptidil - peptid hydrolase các enzym này xúc tác cho sự thuỷ phân các liên kết peptid nội mạch. — Phân loai dưa trẽn các nhóm chức hoat đổng trong trung tâm hoạt động người ta chia protease thành 4 nhóm:
+ Nhóm Serinic: Có nhóm -OH hoạt động là của serin. Các enzym này hoạt động mạnh trong khoảng pH € (7; 11).
+ Nhóm Thiolic: Có nhóm hoạt động là SH
+ Nhóm chứa kim loại: Có các kim loại tham gia vào các phần hoạt động xúc tác, hoạt động mạnh trong khoảng pH € (6,5; 7,5).
+ Nhóm protease - acid: Thường có nhóm hoạt động là nhóm cacboxyl, hoạt động mạnh trong khoảng pH € (1,5; 5).
— Phân loai dưa trẽn vùng pH hoat đổng phân ra: Protein kiềm, trung tính, acid. Tuy nhiên nó chỉ có ý nghĩa thực dụng vì pH tối thích của mỗi enzym phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: Bản chất cơ chất.. .
+ Protease acid: Renin, pepsin
+ Protease trung tính: Amylase, papain
+ Protease kiềm: Tiypsin, chymotrypsin
— Phân loai dưa trẽn nguồn gốc chia ra làm 3 loại:
+ Protease thực vật.
+ Protease động vật: Được tách ra từ những thành phẩn khác nhau trẽn cơ thể động vật.
+ Protease vi sinh: Hệ thống rất phức tạp gồm nhiều enzym giống nhau về cấu trúc, trọng lượng và hình dạng phân tử, thường có trọng lượng phân tử thấp, chủ yếu từ nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn.
— Phân loai dưa vào vi trí tác dung của protease trên liên kết peptid của phân tử protein [3]:
+ Endopeptidase: Chủ yếu phân giải các liên kết peptid nằm trong protein. Phân cắt những đoạn peptid có khối lượng phân tử nhỏ (polypeptid mạch ngắn, pepton.. .) • Nhóm các protease tiêu hoá chủ yếu ở người và động vật: Pepsin và renin trong dịch dạ dày, trypsin và chymotrypsin của tuyến tuỵ và niêm mạc ruột non đều thuộc nhóm này.
+ Exopeptidase: Chủ yếu cắt các liên kết peptid ở hai đầu mạch, vd: Nhóm carboxylpeptidase và aminopeptidase phân giải liên kết peptid từ hai đầu mạch polypeptid có nhóm carboxyl và amin tương ứng, ngoài ra còn có dipeptidase phân giải dipeptid thành các acid amin tự do.
1.2 Bromelain
1.2.1 Đặc điểm cấu tạo của bromelain
— Bromelain (EC 3.4.22.3.2) Là tên gọi chung cho nhóm enzym thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein, được thu nhận từ họ Dứa (Bromeliaceae), đặc biệt là ở thân và trái cây dứa.
— Bromelain là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manóse, 2 glucosamin, 1 xylose và 1 fructose. Sợi hydrat carbon này dường như một nửa sợi không liên quan đến cơ chế xúc tác của phân tử.
— Khi phân tích thành phần aminoacid ở bromelain thân và bromelain quả thì tuỳ theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần acid amin thay đổi khác nhau. Bromelain thân có thành phần aminoacid thay đổi trong khoảng 321 - 144 aminoacid và bromelain quả là 283 - 161 aminoacid.
— Bromelain thân là một chuỗi polypeptid có aminoacid ở đầu là valin đầu N và Glycin đầu C
1.2.2 Cấu trúc không gian của bromelain
— Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc một của bromelain và nhận thấy cách sắp xếp aminoacid trong phân tử bromelain như sau [3]: S e r - Val - Lys - A s n - P r o - Cys - G l y - A l a - C ỵ s - T r y p -- G l y - C y s - L ỵ s –
— Bromelain (EC 3.4.22.3.2) Là một protease, trong trung tâm hoạt động có chứa cystein và hai chuỗi polypeptid liên kết với nhau bằng cầu nối —s—S—. Phân tử có dạng hình cầu do đó cách sắp xếp phức tạp.
— Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulữiydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfit.
Ngoài ra trong phân tử còn có các ion có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzym.
1.2.3 Tính chất của bromelain
— Các nghiên cứu về tính chất vật lý của bromelain thân dứa được Murachi và cộng sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau.
1.2.4.1 Hoạt tính enzym của bromelain
— Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: Peptidase, amidase và esterase, Bromelain thân có hoạt tính enzym với nhiều cơ chất tự nhiên và có thể thuỷ phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp.
— Đối với cơ chất là casein, hoạt tính enzym của bromelain thân cao hơn bromelain quả xanh và bromelain quả chín.
— Nước chiết vỏ dứa có chứa nhiều bromelain hơn nước chiết quả dứa, hoạt tính bromelain trong phần lõi dứa cao gấp 8 - 20 lần ở quả [1].
— Bromelain chiếm 50% protein trong quả dứa, nó có khả năng thuỷ phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6 - 8. Bromelain có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ Sung.
— Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzym của bromelain kể từ 3 tháng trước khi chín và đạt cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín. Khi trái chín hoạt tính bromelain giảm xuống nhưng không mất hẳn. [3]
— Bromelain còn có thể thu được từ trong thân dứa (trung bình có thể thu được 3.6Kg bromelain từ 3781 nước rút ra từ thân cây dứa).
— Giống như các chất xúc tác sinh học khác, bromelain chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như: Cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp tinh khiết.. .
— Thể thương mại: Thể huyền phù trong amoni sulfat 3.2M, pH= 6 [6].
— Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như: Bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hoá.. . [3]
+ Ảnh hưởng bởi cơ chất: Trên những loại cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt tính khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng thuỷ phân của bromelain là mạnh hcm papain 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelain tương tự như papain. Đối với các chất tổng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginin ethyl ester) Thì khả năng thuỷ giải của bromelain yếu hơn papain.
+ Ảnh hưởng bởi nhiêt đỏ: Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: Thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzym.
+ Ảnh hưởng của pH: PH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym. PH tối thích của enzym không ổn định mà phụ thuộc vào nhiệt độ, thòi gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzym, bản chất dung dịch đệm, sự hiện diện của chất hoạt hoá.
Khi thu nhận bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là ammonium sulfat thì enzym có hoạt tính cao nhất ở pH 4,8 và ổn định ở pH 4,6 - 5,4.
1.2.4.2 Các yếu tố ảnh hưỏng đến hoạt tính của bromelainBromelain thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao ở pH 6,0 và 8,0. ổn định ở pH 3,5 - 5,6 với nhiệt độ 63°c. Enzym đã tinh sạch chỉ còn 60 - 70% hoạt tính. Bromelain có biên độ pH rộng 3 -1 0 nhưng pH tối thích của enzym là 5 - 8 tuỳ thuộc vào cơ chất.
+ Ảnh hưởng bởi các ion kim loai: Các ion kim loại có ảnh hưỏfng đến hoạt tính của enzym do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzym. Muối thuỷ ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của bromelain và mức độ kìm hãm thay đổi tuỳ theo nồng độ muối.
Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelain do chúng kết hợp với nhóm SH của trung tâm phản ứng của enzym.
Bromelain là enzym thuỷ phân protein, thuộc nhóm protease thực vật. Một trong những lợi ích của nó được chú ý đến đó là một chất giúp cho tiêu hoá vì nó hoạt động ở môi trường acid trong dạ dày và cả trong môi trường kiềm của ở ruột non.
Bromelain có thể thay thế được cho những enzym tiêu hoá khác như pepsin và trypsin. Bromelain có tác dụng kháng viêm rất hiệu quả trong chữa trị bệnh viêm thấp khớp, do đó các chuyên gia y tế sử dụng bromelain như chất làm giảm đau kháng viêm và giảm sưng. Và đến năm 1963 đã được sử dụng như một dược phẩm dùng trong lâm sàng. Hiệu quả của bromelain là làm g iả m lư ợ n g prostaglandin trong cơ thể gây ra đau, viêm và ngăn cản sự thấm các chất dinh dưỡng qua mô bằng cách ngăn cản những tiền chất gây viêm. Bromelain có ảnh hưởng tích cực trên các prostaglandin hữu dụng [3].
1.2.5 Tác dụng dược lý của bromelain
— Bromelain có tác dụng ức chế quá trình viêm, giảm phù nề và huyết (papain không có tác dụng chống viêm). Bromelain khi được bôi lên các vết thương hoặc vết bỏng sẽ có tác dụng làm tiêu các tổ chức chết, mau thành sẹo.
— Quercetin có tác dụng chống viêm do làm giảm lượng histamin giải phóng ra, mà bromelain làm tăng hấp thu quercetin vì vậy khi dùng kết hợp 2 hoạt chất này sẽ làm tăng tác dụng chống viêm của quercetin. [13]
— Bromelain có tác dụng làm giảm ỉa chảy và mất nước do nhiễm E. Coli, do bromelain tấn công vào cùng một receptor trên thành dạ dày như E. Coli.
— Bromelain là một enzym chống viêm tự nhiên, tác dụng giống như NSAIDs và các thuốc ức chế COX2, dựa trên các tác dụng:
+ Khoá các sản phẩm của prostaglandin gây đau và sưng.
+ Phá huỷ cục máu đông vốn làm cản trở tuần hoàn máu.
— Bromelain còn được sử dụng điều trị cúm, cảm lạnh và nhiễm trùng tai, làm loãng đờm giúp dễ khạc đờm ra.
— Bromelain có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động vật. Nồng độ cao nhất của bromelain được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ, tuy nhiên hoạt động thuỷ phân protein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có lẽ là do tác động của các protease nội sinh và yếu tố a- 2 - macroglobulin của huyết thanh.
— Liều sử dụng bromelain phụ thuộc vào mục đích sử dụng [14]
+ Giúp tiêu hoá: 500mg/ngày chia liều cùng với bữa ăn.
+ Chấn thương: 500mg/4 lần/ngày, uống khi dạ dày rỗng
+ Chống viêm: 500- 2000mg/ngày chia làm 2 liều
Không dùng quá 8-10 ngày trong một đợt điều trị — Chú ý khi sử dụng [15]:
+ Khi dùng liều bình thường, bromelain khá an toàn và hầu như không có các tác dụng ngoài ý muốn
+ Khi dùng liều cao, các tác dụng ngoài ý muốn có thể gặp phải là: Nôn, buồn nôn, ỉa chảy.
------------------------------------------
MỤC LỤC
ĐẶT VÂN ĐỀ
PHẦN 1 TỔNG QUAN
1.1 Đại cương chung về protease
1.2 Bromelain
1.2.1 Đặc điểm cấu tạo của bromelain
1.2.2 Cấu trúc không gian của bromelain
1.2.3 Tính chất của bromelain
1.2.4 Hoạt tính của bromelain
1.2.5 Tác dụng dược lý của bromelain
1.3 a - Chymotrypsin
1.3.1 Cấu trúc của Chymotrypsin
1.3.2 Tính chất của Chymotrypsin
1.3.3 Sự hoạt hoá chymotrypsinogen
1.3.4 Cơ chế hoạt động của a - Chymotrypsin
1.3.5 Tính đặc hiệu của a - Chymotrypsin
PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét
2.2.1 Chiết, tách và tạo chế phẩm bromelain từ Dứa
2.2.2 Xác định hoạt độ protease của bromelain tinh
2.2.3 Xác định hoạt độ enzyme của a - Chymotrypsin
2.2.4 Xác định tỉ lê phối hợp thích hợp của bromelain và AC
2.2.5 Nghiên cứu độ bền hoạt độ của hỗn hợp enzym
2.3 Bàn luận
PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
3.1 Kết luận
3.2 Đề xuất
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
---------------------------------------------
keyword: download,khoa luan tot nghiep,duoc si,nghien cuu,phoi hop,bromelain va a- chymotrypsin,voi ti le thich hop,ve hoat do enzym,va do ben hoat tinh,de lam thuoc,nguyen ich tuan
Linkdownload: KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC SĨ
Nhận xét
Đăng nhận xét