NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÁC GAM CHUẨN CHO RT-PCR ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN CÚM VÀ KIỂM ĐỊNH CÔNG HIỆU VẮC XIN SỞI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÁC GAM CHUẨN CHO RT-PCR ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN CÚM VÀ KIỂM ĐỊNH CÔNG HIỆU VẮC XIN SỞI

CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

AAdenin

ACVAciclovir

ADCCAntibody-dependent cellular cytotoxicity (Đáp ứng miễn dịch gây độc qua trung gian tế bào phụ thuộc kháng thể)

ARNRibonucleic acid (Acid ribonucleic)

ADNDeoxyribonucleic acid (Acid deoxyribonucleic)

CDCCenters for disease control and prevention (Trung tâm Phòng và Kiểm soát Bệnh tật)

CEFChicken embryonic fibroblast (Nguyên bào sợi phôi gà)

CMVCytomegalovirus

CoPCorrelate of protection (Yếu tố bảo vệ)

CPE:Cytopathic effects (Hủy hoại tế bào)

CtThreshold cycle (Chu kỳ ngưỡng)

CVCoefficient of variation (Hệ số biến thiên)

EDTAEthylenediamin tetraacetic acid

ELISAEnzyme-linked immunosorbent assay (Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzyme)

EQAExternal quality assessment (Chương trình đánh giá chất lượng từ bên ngoài)

FCSFetal calf serum (Huyết thanh bê bào thai)

FDAFrench development agency (Cơ quan Phát triển Pháp) HAHaemagglutination (Ngưng kết hồng cầu) hAdVHuman adenovirus (Virus adeno gây bệnh ở người) hCoVHuman coronavirus (Virus corona gây bệnh ở người)

HIVHuman immunodeficiency virus (Virus gây suy giảm miễn dịch ở người)

HIHaemagglutination inhibition (Ức chế ngưng kết hồng cầu) hMPVHuman metapneumovirus (Virus gây viêm phổi ở người)

HPVHuman papillomavirus (Virus gây u nhú ở người) hRSVHuman respiratory syncytial virus) (Virus hợp bào hô hấp)

HRVHuman rhinovirus (Virus rhino gây bệnh ở người) hSLAMHuman signaling lymphocyte activation marker (Phân tử dấu ấn tín hiệu hoạt hóa tế bào lympho ở người)

HSVHerpes simplex virus (Virus herpes simplex)

IFAImmunofluorescence assay (Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang)

ILIInfluenza-like illness (Bệnh tương tự cúm/hội chứng cúm)

IQCInternal quality control (Chương trình nội kiểm)

ISOInternational standard organization (Tổ chức Tiêu chuẩn quốc tế)

LogLogarit (cơ số 10) MDCKMadin-Darby canine kidney (Tế bào thường trực thận chó)

MMRMeasles - Mumps - Rubella (Sởi - Quai bị - Rubella)

NAT:Nucleic acid testing (Xét nghiệm acid nucleic)

NCBINational center for biotechnology information (Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học)

NIHNational institute of health (Viện Sức khỏe quốc gia)

NKNatural killer (Tế bào diệt tự nhiên)

ODOptical density (Mật độ quang)

OMVOuter membrance vesicle (Túi màng ngoài/vô bào)

OPVOral polio vaccine (Vắc xin bại liệt uống)

PCRPolymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) pdmPandemic (Đại dịch)

PFAFoscarnet

PFUPlaque forming unit (Đơn vị tạo đám hoại tử)

QAQuality assurance (Đảm bảo chất lượng)

QCQuality control (Kiểm soát chất lượng)

RFLPRestriction fragments length polymorphism (Phản ứng đa dạng chiều dài đoạn cắt enzyme giới hạn)

RNPRibonucleoprotein (Phức hợp ribonucleoprotein)

RORRougeole - Oreillons - Rubéole (Sởi - Quai bị - Rubella)

RT-PCRReverse transcriptase polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược)

SASialic acid (Acid sialic)

SARISevere acute respiratory infection (Viêm đường hô hấp cấp tính nặng)

SDSSodium dodecyl sulfate

SISEASurveillance and investigation of endemic situations in South-East Asia (Giám sát và điều tra tình hình dịch ở Đông Nam Á)

SOPStandard operating procedures (Quy trình thực hành chuẩn)

SVPSevere viral pneumonia (Viêm phổi nặng do virus)

TThymine

TCID50Tissue culture infectivity dose (Liều gây nhiễm 50% nuôi cấy tế bào)

VeroVerda reno (Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi)

VLPViral-like particle (Phần tử tương tự hạt virus)

VZVVaricella-Zoster virus

WHOWorld Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) 

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

I.TỔNG QUAN

1.1.Tổng quan một số vấn đề về cúm

1.1.1.Phép gọi tên

1.1.2.Hình thái, cấu trúc

1.1.3.Kháng nguyên và tính đa dạng chủng

1.1.4.Sự nhân lên của virus cúm

1.1.5.Dịch tễ học

1.1.6.Chẩn đoán phòng thí nghiệm

1.1.7.Điều trị

1.1.8.Tình hình nghiên cứu về cúm và tỷ lệ nhiễm cúm

1.2.Tổng quan một số vấn đề về sởi

1.2.1.Phép gọi tên

1.2.2.Hình thái, cấu trúc

1.2.3.Sự nhân lên của virus

1.2.4.Các triển vọng thanh toán sởi

1.2.6.Các nghiên cứu liên quan đến sởi

1.3.Sản xuất chứng dương ARN in vitro và kiểm định công hiệu vắc xin

II.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng nghiên cứu

2.2.Vật liệu nghiên cứu

2.2.1.Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc

2.2.2.Sinh phẩm hóa chất

2.2.3.Mồi và đầu dò

2.2.4.Tế bào

2.2.5.Phần mềm phân tích và nguồn thông tin

2.3.Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.Sản xuất chứng dương ARN in vitro 2.3.2.Xác định tỷ lệ nhiễm cúm

2.3.2.Xây dựng phương pháp kiểm định vắc xin sởi

III.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1.Sản xuất chứng dương ARN

3.1.1.Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã cổ điển

3.1.2.Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã trực tiếp

3.1.3.Phiên mã

3.2.Xác định tỷ lệ nhiễm cúm bằng RT-PCR

3.2.1.Đặc điểm đối tượng nghiên cứu

3.2.2.Đặc điểm trường hợp tử vong do cúm

3.2.3.Ứng dụng chứng dương trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm

3.2.4.Tỷ lệ đồng nhiễm cúm và các virus khác

3.2.5.Phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian

3.3.Kiểm định công hiệu vắc xin sởi

3.3.1.Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng tạo đám hoại tử

3.3.2.Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng real-time RT-PCR

3.3.3.Sự ổn định của ARN tách chiết bằng TpLR

3.3.4.Công hiệu vắc xin sởi thành phẩm

3.3.5.Độ lặp lại của phản ứng

IV.BÀN LUẬN

4.1.Kết quả sản xuất các gam chuẩn

4.1.1.Tạo dòng plasmid tái tổ hợp và chuyển nạp

4.1.2.Kiểm tra chuyển nạp

4.1.3.Tạo mạch thẳng ADN plasmid bằng cắt enzyme giới hạn

4.1.4.Kết quả phiên mã in vitro

4.2.Tỷ lệ nhiễm cúm tại Hải Dương năm 2009-2011

4.2.1.Đặc điểm đối tượng nghiên cứu

4.2.2.Tỷ lệ tử vong và nhiễm cúm của bệnh nhân SARI

4.2.3.Phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian

4.3.Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hiệu giá vắc xin sởi đơn bằng real-time RT- PCR

4.3.1.Thử nghiệm tối ưu hóa các điều kiện phản ứng 4.3.2.Công hiệu vắc xin sởi thành phẩm

4.3.3.Thẩm định phương pháp

4.4.Bàn luận về các ưu điểm của đề tài 143

4.4.1.Chất lượng của sinh phẩm

4.4.2.Trang thiết bị máy móc

4.4.3.Quy trình thực hiện thử nghiệm

4.4.4.Phân tích kết quả và sự phù hợp với mục tiêu nghiên cứu

4.4.5.Chứng của phòng thí nghiệm và chứng quốc tế

4.4.6.Hoạt động độc lập

4.5.Bàn luận về những hạn chế của đề tài

4.5.1.Hạn chế trong sản xuất chứng dương ARN in vitro

4.5.2.Hạn chế trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm

4.5.3.Hạn chế trong nghiên cứu xác định công hiệu vắc xin sởi

KẾT LUẬN - NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - ĐỀ XUẤT

TÀI LIỆU THAM KHẢO

CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN

Hình 1.1.Cấu trúc hạt virus cúm

Hình 1.2.Nguồn gốc các chủng cúm đại dịch 1918-1977

Hình 1.3.Cơ chế phiên mã của virus cúm A

Hình 1.4.Sơ đồ chẩn đoán phòng thí nghiệm của cúm

Hình 1.5.Cấu trúc của oseltamivir (a) và zanamivir (b)

Hình 1.6.Nguồn gốc chủng cúm A/H1N1pdm2009

Hình 1.7.Các ca bệnh và phân típ cúm tại Trung quốc, 2009-2013

Hình 1.8.Các ca bệnh và phân típ cúm tại Hoa Kỳ, 2009-2013

Hình 1.9.Lưu hành cúm và phân típ cúm tại Việt Nam, 2006-2012

Hình 1.10.Tỷ lệ nhiễm cúm và phân típ cúm ở bệnh nhân SARI, 2011-2012

Hình 1.11.Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử và sơ đồ virus sởi

Hình 1.12.Sơ đồ bộ máy di truyền (genome) của virus sởi

Hình 1.13.Sơ đồ nhân lên của virus sởi

Hình 1.14.Sơ đồ quá trình sản xuất chủng vắc xin sởi

Hình 2.1.Sơ đồ quá trình phiên mã (cổ điển và trực tiếp)

Hình 2.2.Sơ đồ cơ chế phiên mã cổ điển

Hình 2.3.Sơ đồ cơ chế phiên mã trực tiếp

Hình 2.4.Sơ đồ xét nghiệm của dự án SISEA

Hình 2.5.Sơ đồ thử nghiệm tạo đám hoại tử

Hình 2.6.Xây dựng phương pháp xác định công hiệu vắc xin sởi bằng real-time RT-PCR

Hình 3.1.Khuếch đại các đoạn gen cho phản ứng tạo dòng

Hình 3.2.Chuyển nạp đoạn gen 7 virus cúm mùa A

Hình 3.3.Kiểm tra chuyển nạp đoạn gen 7 virus cúm mùa A bằng PCR

Hình 3.4.Kiểm tra chuyển nạp bằng giải trình tự gen

Hình 3.5.Hình ảnh Blast với ngân hàng gen của virus cúm mùa A

Hình 3.6.Sơ đồ vị trí khuếch đại virus cúm mùa A

Hình 3.7.Tạo plasmid mạch thẳng chứa đoạn gen 7 virus cúm mùa A

Hình 3.8.Khuếch đại với mồi cải biên đoạn gen 7 virus cúm A/H1N1pdm09 Hình 3.9.Chứng dương phiên mã

Hình 3.10.Kiểm tra độ tinh sạch ARN

Hình 3.11.Đo nồng độ ARN virus cúm A/H1N1pdm09

Hình 3.12.Hỗn dịch chứng dương virus cúm mùa A và cúm B

Hình 3.13.Chuẩn độ chứng dương ARN gen N virus sởi

Hình 3.14.Tỷ lệ dương tính với virus cúm ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương

Hình 3.15.Tỷ lệ nhiễm cúm trong tổng số các ca SARI dương tính với virus

Hình 3.16.Đồng nhiễm cúm với các virus khác

Hình 3.17.Phân bố cúm theo giới tính ở bệnh nhân SARI

Hình 3.18.Phân bố cúm theo nhóm tuổi ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương

Hình 3.19.Phân bố cúm theo thời gian

Hình 3.20.Tương quan của 3 phương pháp tách chiết ARN

Hình 3.21.Tương quan hiệu giá PFU và ARN

Hình 3.22.Biểu đồ Levey-Jennings hiệu giá PFU và ARN vắc xin sởi

Hình 3.23.Độ lặp lại trong cùng một lần làm phản ứng

Hình 3.24.Đường thẳng tuyến tính của phản ứng real-time

Hình 4.1.Sơ đồ cơ chế phản ứng tạo dòng (clonning)

Hình 4.2.Cơ chế bù α lựa chọn các tế bào cảm biến

Hình 4.3.Bản đồ genome của véc-tơ pGEM T-Easy

Hình 4.4.Quá trình thẩm định một phương pháp sinh học

CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN

Bảng 1.1.Họ Paramyxoviridae

Bảng 2.1.Mồi và đầu dò đặc hiệu khuếch đại sởi và cúm

Bảng 2.2.a.Pha hỗn dịch tạo dòng (TOPO®pCR2.1 - Invitrogen)

Bảng 2.2.b.Pha hỗn dịch tạo dòng (pGEM T Easy - Promega)

Bảng 2.3.Pha hỗn dịch phiên mã

Bảng 2.4.Pha hỗn dịch phản ứng RT-PCR đa mồi phát hiện cúm A,hRSV, cúm B và hMPV

Bảng 2.5.Khẳng định cúm mùa A và cúm B bằng PCR bán tổ

Bảng 3.1.Chiều dài các đoạn gen đích và ngưỡng phát hiện thấp

Bảng 3.2.Sản lượng phiên mã

Bảng 3.3.Tỷ lệ nhiễm cúm ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương, 2009-2011

Bảng 3.4.Tỷ lệ đồng nhiễm của cúm

Bảng 3.5.Các loại virus và số lượng đồng nhiễm với virus cúm

Bảng 3.6.Phân bố cúm theo giới tính

Bảng 3.7.Phân bố cúm theo nhóm tuổi ở bệnh nhân SARI

Bảng 3.8 Phân bố cúm mùa A và cúm B theo thời gian trong năm

Bảng 3.9.Hiệu giá PFU của vắc xin mẫu chuẩn M-0107

Bảng 3.10.Hiệu giá ARN ở 24, 48, và 72 giờ (M-0107)

Bảng 3.11.Bền vững của ARN ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian thực

Bảng 3.12.Sự khác biệt Ct khi thử nghiệm trên tấm nhựa 24 và 96 giếng

Bảng 3.13.Hiệu giá ARN vắc xin sởi thành phẩm sản xuất tại Việt Nam

Bảng 3.14.Độ lặp lại trong cùng một lần làm phản ứng

Bảng 3.15.Độ lặp lại trung gian của gam chuẩn ngoài

Bảng 3.16.Độ lặp lại của 10 loạt vắc xin giữa 2 ngày thử nghiệm

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization - WHO), hàng năm, trên thế giới có khoảng 30 triệu người mắc và 1 triệu người tử vong vì sởi, tập trung nhiều nhất ở những nước đang phát triển và virus sởi vẫn được coi là “kẻ giết hại trẻ em”. Theo Trung tâm Phòng và Kiểm soát bệnh tật (Centers for Diseases Control and Prevention - CDC) Hoa Kỳ, giai đoạn 2000-2008, số tử vong sởi đã giảm từ 733.000 xuống 164.000 nhưng ở khu vực Tây Thái Bình Dương, con số này chỉ đạt 4% chỉ tiêu [1-4]. Vắc xin góp phần quyết định thành công của chiến lược khống chế và thanh toán sởi toàn cầu [3]. Việt Nam đã sản xuất thành công vắc xin sởi đơn, sống giảm độc lực nên kiểm định công hiệu là một bước rất quan trọng [3]. Kiểm định công hiệu vắc xin bằng các phương pháp hiện hành tốn thời gian, công sức, và kết quả đôi khi phụ thuộc vào chủ quan người đọc cũng như nhiều yếu tố khách quan khác [2],[5]. Gần đây, kiểm định công hiệu vắc xin bằng real-time PCR/RT- PCR có thể khắc phục được những yếu điểm trên [5-8]. Sự phát triển của khoa học vắc xin chính là một nhánh của phát triển khoa học nói chung, trong đó các kỹ thuật mới của chẩn đoán và nghiên cứu đã và đang được áp dụng cho nghiên cứu sản xuất vắc xin, bao gồm cả kiểm định [5-10].

Đại dịch cúm kinh hoàng nhất trong lịch sử xảy ra năm 1918 làm chết hơn 20 triệu người trên thế giới, các đại dịch năm 1957, 1968, và 1977 không trầm trọng như năm 1918 [11-14]. Tại Việt Nam, kể từ khi ca bệnh cúm gia cầm A/H5N1 ở người đầu tiên được xác định tháng 12 năm 2003, đã có bốn đợt dịch ở người xảy ra tại 32 Tỉnh/Thành phố với hơn 100 ca mắc và một nửa trong số đó đã tử vong [14-17]. Trên phạm vi cả nước, từ tháng 9/2009- 03/2010, đại dịch cúm A (A/H1N1pdm09) đã có 11.214 ca mắc và 58 trường hợp tử vong [18].

Có thể chẩn đoán sởi và cúm cũng như xác định phân típ cúm A bằng RT-PCR [19-21]. Để có thể kiểm soát chất lượng và định lượng ARN trong RT-PCR thì cần phải có gam chuẩn ngoài (chứng dương đã biết nồng độ) [5],[22]. Đây là một yêu cầu bắt buộc nhưng hiện tại nhiều phòng thí nghiệm thường tách chiết ARN từ một mẫu bệnh phẩm đã được chẩn đoán trước đó để coi như chứng dương nên không tinh khiết, không định lượng được [5],[23-27]. Ngoài ra, lượng bệnh phẩm có hạn và đôi khi nhân viên xét nghiệm phải đối mặt với nguy hiểm khi tiếp xúc với bệnh phẩm của bệnh nhân nặng [28-31]. Một số phòng thí nghiệm khác lại sử dụng plasmid hay tính theo đơn vị tạo đám hoại tử (Plaque Forming Unit - PFU) để làm chứng dương cho RT-PCR, điều này cũng không tối ưu vì ADN không thể kiểm soát chất lượng của bước phiên mã ngược và PFU chỉ đo lường virus có hoạt tính và lượng ARN chứng sẽ quá nhiều [32-36].

Trong khi đó, sản xuất ARN in vitro khắc phục được những hạn chế của sử dụng ARN tách chiết từ bệnh phẩm [33],[37]. Dựa vào những ưu điểm nổi bật trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho RT-PCR, ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu vắc xin sởi” được xây dựng nhằm các mục tiêu:

1. Sản xuất được các gam chuẩn cho RT-PCR phát hiện đồng thời ARN virus cúm A, B (M); cúm A/H5N1 (M, H5 và N1); và sởi (N);

2. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm mùa và phân típ cúm gia cầm A/H5N1 (nếu có) tại Hải Dương năm 2009 bằng RT-PCR;

3. Xác định công hiệu vắc xin sởi đơn sản xuất tại Việt Nam bằng real- time RT-PCR một bước.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Sởi và cúm là hai bệnh do virus gây ra, được đề cập trong Y văn từ trước Công nguyên, qua thời kỳ Trung cổ, các cuộc chiến tranh và cho đến ngày nay. Những nghiên cứu về mọi khía cạnh của cúm và sởi thực sự lớn, khi vào trang mạng http://www.google.com. (xem tháng 2 năm 2014), chỉ mất 0,25 giây là có tới 45.200.000 kết quả liên quan đến cúm và con số tương ứng cho sởi là 0,32 giây với 9.910.000 kết quả.

1.1. Tổng quan một số vấn đề về cúm

Cúm là một bệnh nhiễm virus đường hô hấp cấp tính, thường để lại dấu ấn dịch qua từng thế kỷ [1]. Hàng năm, thế giới có 3-5 triệu người mắc cúm nặng với 250.000-500.000 trường hợp tử vong. Giữa các đại dịch, virus cúm A và B vẫn gây dịch hàng năm [39],[40]. Đôi khi, người ta phát hiện được các trường hợp cúm C ở người [41]. Cúm gia cầm A/H5N1 ở động vật vẫn chưa được kiểm soát trên phạm vi toàn cầu, lây truyền từ động vật sang người và gây tử vong [15],[16],[42],[43].

1.1.1. Phép gọi tên

Các virus cúm thuộc trên họ Mononegavirale, họ Orthomyxoviridae, được phân thành các típ (sau năm 2002 đổi thành chi) A, B, và C dựa vào quyết định kháng nguyên nucleoprotein (NP). Họ Orthomyxoviridae còn có các chi Isavirus, Quaranjavirus, và Thogotovirus [1],[2],[38]. Virus cúm A gồm các phân típ dựa vào sự thay đổi hoàn toàn quyết định kháng nguyên haemagglutinin (HA) của thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin Inhibition - HI), virus cúm B chỉ có duy nhất một phân típ [1],[2],[38].

1.1.2. Hình thái, cấu trúc

Hạt virus cúm A và cúm B đa hình thái, những phân lập mới thường có dạng hình sợi nhưng lại có dạng hình cầu khi được cấy chuyển trên nuôi cấy tế bào hoặc trứng gà ấp dở. Virus hình cầu có kích thước 80-120nm gồm 70- 75% protein, 20% lipid, và 1% ARN [1],[2],[38].  Nguồn: S. Munier - Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44].

Thành phần cấu trúc từ trong ra ngoài của hạt virus gồm bộ máy di truyền (genome), capsid và vỏ ngoài (envelop). Genome virus cúm A và cúm B chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN phân cực âm, có phân đoạn (Hình 1.1) với tên gọi hoặc là theo đoạn ARN, hoặc dựa vào chức năng tạo nên cấu trúc hạt virus. Đoạn 1 đến 8 tương ứng mã hóa các protein PB2, PB1/N40/PB1F2, PA/PA-X, HA, NP, NA, M1/M2/M42, NS1/NEP [1],[2],[38],[44],[45]. Đề tài nghiên cứu này khuếch đại các khu vực ổn định 5 của các đoạn gen 7 mã hóa protein M virus cúm mùa A (H3N2 và H1N1), virus cúm B, và các đoạn gen 7, 6, 4 mã hóa tương ứng protein M, HA và NA của virus cúm gia cầm A/H5N1 và đoạn gen 7 của virus cúm đại dịch A/H1N1pdm09.

1.1.3. Kháng nguyên và tính đa dạng chủng

Chuyển đổi kháng nguyên đột ngột (shift) là thay đổi cấu trúc kháng nguyên bề mặt, chủ yếu là HA, do tổ hợp lại vật liệu di truyền của các phân típ khác nhau và thường gây hiện tượng thay thế một loại HA mới, nhìn chung không chịu tác dụng của miễn dịch tồn tại trước đó và đây chính là nguyên nhân của các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ XX và XXI [1],[2],[11- 13],[38],[46]. Đây là điểm đáng lưu ý trong chẩn đoán cúm và xác định phân típ cúm A bằng RT-PCR vì khi một đoạn gen bị thay thế thì có thể phải thiết Thích ứng     Tổ hợp     Tổ hợp trực tiếp       lại        lại 6 kế lại cặp mồi và đầu dò (real-time) đặc hiệu, đồng thời phải sản xuất lại chứng dương ARN.

Nguồn gốc các đại dịch cúm có thể hoặc là do hiện tượng tổ hợp lại các đoạn gen, hoặc là do thích ứng trực tiếp từ loài khác [1],[13],[38],[46]. Chi tiết, cúm đại dịch A/H1N1 năm 1918 có thể do thích ứng trực tiếp từ A/H1N1 thủy cầm hoặc do tổ hợp từ một nguồn khác không rõ (không có số liệu di truyền trước 1918), sau đó đại dịch cúm năm 1957 là do tổ hợp của  đoạn gen chủng A/H1N1 năm 1918 và 3 đoạn gen HA, NA, PB1 của chủng A/H2N2 thủy cầm để tạo thành virus A/H2N2 đại dịch 1957. Đại dịch cúm 1968 là do tổ hợp của 6 đoạn gen chủng 1957 và 2 đoạn gen HA và PB1 của A/H3Nx thủy cầm để hình thành chủng A/H3N2 đại dịch 1968 Hong Kong và chủng này hiện lưu hành như một chủng cúm mùa đến tận ngày nay. Chủng cúm mùa A/H1N1 hiện tại là do chủng đại dịch 1977 tiếp tục lưu hành (Hình 1.2).

Biến đổi kháng nguyên từ từ (drift) là những thay đổi nhỏ và liên tục các acid amin hoặc đột biến điểm tại các khu vực kháng nguyên protein vỏ HA và NA do lỗi của ARN polymerase hoặc do hiện tượng áp lực chọn lọc miễn dịch của kháng thể. Những chủng này không chuyển đổi hoàn toàn kháng nguyên do vậy vẫn chịu một phần miễn dịch từ những lần nhiễm cúm trước và chủng mới nổi trội hơn chủng cũ [1],[38]. Đây cũng là một điểm quan trọng cần lưu ý trong thiết kế mồi. Mặc dù không có hiện tượng thay thế một đoạn gen hoàn toàn mới nhưng nhiều đột biến điểm có thể làm thiết kế mồi thông thường không phát hiện được hết các chủng, chính vì vậy nhiều tác giả đã áp dụng phương pháp thiết kế thoái hóa mồi để tăng độ nhạy phát hiện của cặp mồi và đầu dò. Điều này đặc biệt quan trọng trong chẩn đoán cúm gia cầm A/H5N1 ở người [47].

1.1.4. Sự nhân lên của virus cúm

Các hệ thống tế bào phân lập virus cúm là tế bào thận khỉ tiên phát và tế bào thường trực thận chó (Madin-Darby Canine Kidney - MDCK). Phân lập virus cúm trên nuôi cấy tế bào có thể có hoặc không tạo hủy hoại tế bào (Cytopathic Effects - CPE) [2],[19].

Virus được hấp phụ trên bề mặt tế bào vật chủ qua thụ thể tế bào là acid sialic (SA) và xâm nhập vào tế bào qua con đường endocytosis. Acid sialic gắn với galactose qua cầu nối α2,3 hoặc α2,6. Đây chính là yếu tố quyết định độc lực của một số chủng virus và bệnh cảnh lâm sàng vì ở đường hô hấp trên thì α2,6 nhiều hơn hẳn α2,3 và ngược lại với đường hô hấp dưới [1],[44],[45].

Sau hấp phụ, nhờ pH thấp của khoang nội bào mà HA tạo ra hiện tượng tiền thay đổi phù hợp về hình thái để peptide hòa màng tiến gần tới màng của nội bào, chèn peptide hòa màng vào màng của nội bào. Sau đó, hiện tượng bán hòa màng xảy ra, màng của virus và màng của tế bào vật chủ được kéo lại gần nhau rồi hình thành nên một lỗ hòa màng, tiếp đó xuất hiện những thay đổi phù hợp để bộc lộ peptide hòa màng làm cho kênh ion M2 bơm các proton để giải phóng phức hợp ribonucleoprotein (RNP) của virus và màng virus hòa với màng của khoang nội bào. ARN được vận chuyển vào nhân tế bào qua lỗ màng nhân nhờ RNP gắn với α và β karyopherin [1],[44],[45],[48].

Tại nhân tế bào, ARN virus đóng vai trò làm khuôn mẫu tổng hợp ARN bổ trợ chuỗi dương, sau đó đến lượt ARN chuỗi dương này làm khuôn mẫu để tổng hợp trở lại ARN virus chuỗi âm và ARN thông tin. Cụ thể, phức hợp RNP gắn với 3 polymerase có vai trò thiết yếu trong quá trình nhân lên của virus cúm. PA có khu vực endonuclease và vị trí gắn với PB1, PB1 có vị trí gắn với PA và vị trí gắn với PB2, PB2 có vị trí gắn với PB1 và vị trí gắn với cấu trúc “đội mũ” của tiền ARN thông tin (Hình 1.3) [1],[44],[45],[49-51].

ARN virus cúm có cấu trúc “đội mũ” m7GpppXm(N10-13) và nó được PB2 sử dụng như đoạn mồi để khởi đầu quá trình phiên mã và sau đó PA của virus sẽ cắt cấu trúc mũ của ARN thông tin. Quá trình tổng hợp chuỗi bổ trợ được xúc tác nhờ enzyme PB1, chính là ARN polymerase phụ thuộc ARN dựa trên khuôn mẫu là ARN virus. Sau cùng, quá trình tổng hợp chuỗi kết thúc khi xuất hiện tín hiệu poly A từ cấu trúc khuôn mẫu poly U (Hình 1.3)...

...

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Fields B.N (2000). Virology, fourth edition, Lippincott Williams and Wilkins. Philadenphia.

2. Lennette E.H., Lennette D.A., Lennette E.T (1995). Diagnostic Procedures for Virals, Rickettsial and Chlamydial infection, seventh edition. American Public Health Association, Washington.

3. Billeter A.M., Meulen V.T (1995). Measles Virus. Springer Produktions – Gesellschaft. Berlin. 1-300.

4. Centers for Disease Control and Prevention (2009). Global Measles Mortality, 2000-2008. MMWR, 58(47), 1321-1326.

5. Nguyễn Thị Thường, Henri Agut et al (2006). Rapid determination of antiviral drug susceptibility of herpes simplex virus types 1 and 2 by real- time PCR. Antiviral Research, 69, 152-157.

6. Schalk J.A., De Vries C.G., Jongen P.M (2005). Potency estimation of measles, mumps and rubella trivalent vaccines with quantitative PCR infectivity assay. Biologicals, 2(33), 71-79.

7. Ammour Y., Faizuloev E., Borisova T et al (2013). Quantification of measles, mumps and rubella viruses using real-time quantitative TaqMan- based RT-PCR assay. J Virol Methods, 187(1), 57-64.

8. Prabhu M., Siva Sankar M.S., Bhanuprakash V., Venkatesan G., Bora D.P., Yogisharadhya R., Balamurugan V (2012). Real time PCR: a rapid tool for potency estimation of live attenuated camelpox and buffalopox vaccines. Biologicals, 40(1), 92-95.

9. Guy B., Saville M., Lang J (2010). Development of Sanofi Pasteur tetravalent dengue vaccine. Human vaccines, 6(9), 696-705.

10. Bougeon M.L (2013). Measurement of immune response during vaccine trials. Training course on immunology and vaccinology. http://www.ip.bio- med.ch/cms/Default.aspx.

11. Morens D.M., Fauci A.S (2007). The 1918 influenza pandemic: insights for the 21st century. J Infect Dis, 195, 1018-1028.

12. Pandemic flu history. http://www.flu.gov/pandemic/history/

13. Edwin D. K. (2006). Influenza Pandemics of the 20th Century. Emerging Infectious Diseases,12(1), 9-14.

14. Taubenberger J.K., Morens D.M (2006). 1918 influenza: the mother of all pandemics. Emerging Infectious Diseases,12, 15-22.

15. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Nguyễn Ngọc Linh, Hoàng Vũ Mai Phương, Nguyễn Tùng, Jile J., Patridge J., Nguyễn Trần Hiển, Lê Quỳnh Mai (2013). Sự tiến hóa và phân tách của vi rút cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 clade 2.3.4 tại Việt Nam 2005-2010. Tạp chí Y học dự phòng, 11(147), 3-5.

16. Lê Quỳnh Mai et al (2005). Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus, Nature, (437), 1108.

17. Nguyễn Trần Hiển (2007). Avian influenza in Vietnam: Epidemiology, lessons learned in prevention and control. 4^th Pasteur virology training course in Hong Kong.

18. Cục Y tế dự phòng và Môi trường - Bộ Y tế (2010). Đại dịch cúm giai đoạn 2007-2010.

19. World Health Organization (2011). Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza. Global Influenza Surveillance Network.

20. World Health Organization/USCDC (2009). CDC protocol of realtime RTPCR for influenza A(H1N1). who.int.

21. World Health Organization (2007). Manual for the laboratory diagnosis of measles viral infection, second edition, Department of vaccines and biologicals.

22. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R (1993). Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology,11, 1026- 1030.

23. Kwok S., Higuchi R (1989). Avoiding false positives with PCR. Nature, 339, 237-238.

24. Cross N.C., Lin F., Goldman J (1994). Appropriate controls for reverse transcription polymerase-chain reaction (RT-PCR). British Journal of Haematololy, (87), 218.

25. Kidd V.J (1997). Problematic controls for reverse transcription polymerase chain reactions (RT-PCR): an issue revisited. Leukemia, 11, 873-874.

26. Đỗ Phương Loan, Bùi Minh Trang, Phan Thị Ngà. (2013). Phát triển kỹ thuật real-time RT-PCR phát hiện và xác định kiểu gen GI và GIII của virus viêm não Nhật Bản. Tạp chí Y học dự phòng, 11(147), 31-35.

27. Nguyễn Thị Kiều Anh, Ngô Châu Giang, Nguyễn Vĩnh Đông (2008). Phát hiện nhanh vật liệu di truyền của virut dại bằng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp. Tạp chí Y Dược học quân sự, 33, 114-118.

28. Qiagen (2007). QIAampR DNA mini kit and QIAamp DNA blood mini kit handbook, second edition

>>> DOWNLOAD LUẬN ÁN GAM CHUẨN RT- CPR..