TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE

(LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC)

MỤC LỤC

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, sơ đồ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
 1.1. Histon deacetylase 2
 1.1.1. Histon acetyltransferase 4
 1.1.2. Histon deacetylase 4
 1.1.2.1. Phân loại 5
 1.1.2.2. Cấu trúc của HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa 7
 1.1.3. Mối liên quan giữa ung thư và sự bất thường hoạt động của HAT
hoặc HDAC
 1.2. Các chất ức chế HDAC.
1.2.1. Phân loại.
1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC.
1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC.
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về các chất ức chế HDAC.
1.3.1. Các peptid vòng.
1.3.2. Dẫn chất benzamid.
1.3.3. Các acid béo mạch ngắn.
1.3.4. Các dẫn chất ceton.
1.3.5. Các hydroxamat và dẫn chất.
1.3.5.1. Thay đổi cầu nối.
1.3.5.2. Thay đổi nhóm khóa hoạt động.
1.3.5.3. Thay đổi nhóm chức hydroxamic.
1.4. Các phương pháp tạo liên kết amid và tổng hợp acid hydroxamic.
1.4.1. Các phương pháp tạo liên kết amid.
1.4.1.1. Acyl halid.
1.4.1.2. Acyl azid.
1.4.1.3. Acylimidazol.
1.4.1.4. Anhydrid.
1.4.1.5. Ester.
1.4.2. Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic.
1.4.2.1. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester.
1.4.2.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
 2.1. Nguyên liệu.
2.2. Thiết bị.
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Nội dung nghiên cứu.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.2.1. Phương pháp tổng hợp.
2.3.2.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết.
2.3.2.3 Phương pháp phân tích cấu trúc.
2.3.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học.
2.3.2.5. Docking.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.
3.1. Tổng hợp hóa học và phân tích dữ liệu phổ.
3.1.1. Các dẫn chất N1 - (benzo [d] thiazol - 2 - yl) - N4 - hydroxysuccinamid vàN1 - (benzo [d] thiazol - 2 - yl) - N5 - hydroxyglutaramid
 3.1.1.1. Kết quả tổng hợp.
3.1.1.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất 3a - f và 5a - f.
3.1.2. Các dẫn chất N1 - (benzo [d] thiazol - 2 - yl) - N6 - hydroxyadipamid vàN1 - (benzo [d] thiazol - 2 - yl) - N8 - hydroxyoctandiamid
 3.1.2.1. Kết quả tổng hợp.
3.1.2.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất 7a - f và 9a - h.
3.1.3. Tổng hợp chất N1 - (thiazol - 2 - yl) - N8 - hydroxyoctandiamid (.)
3.1.4. Các dẫn chất N1 - (benzo [d] thiazol - 2 - yl) - N4 - (3 - (hydroxyamino) - 3 - oxopropyl) succinamid và N1 - (benzo [d] thiazol - 2 - yl) - N5 - (2 - (hydroxy amino) - 2 - oxoethyl) glutaramid
 3.1.4.1. Kết quả tổng hợp.
3.1.4.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất. a - d và. a - f.
3.1.5. Các dẫn chất N1 - (3 - (hydroxyamino) - 3 - oxopropyl) - N4 - phenylsuccinamid và N1 - (2 - (hydroxyamino) 2 - oxoethyl) - N5 - phenyl glutaramid
 3.1.5.1. Kết quả tổng hợp.
3.1.5.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất. a - c, f, h và. a - h.
3.1.6. Tổng hợp N1 - (4 - clorophenyl) - N6 - (3 - (hydroxyamino) - 3 - oxopropyl) adipamid
 3.2. Hoạt tính sinh học.
3.2.1. Tác dụng ức chế HDAC.
3.2.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro.
3.2.3. Hoạt tinh kháng tế bào ung thư in vivo.
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN.
4.1. Tổng hợp hóa học.
4.1.1. Tác nhân acyl hóa là anhydrid acid.
4.1.2. Tác nhân acyl hóa là acid carboxylic.
4.1.3. Tác nhân acyl hóa là ester.
4.2. Khẳng định cấu trúc.
4.2.1. Phổ hồng ngoại.
4.2.2. Phổ khối lượng.
4.2.2.1. Phân tích cụm pic ion phân tử.
4.2.2.2. Cơ chế phá mảnh của phân tử theo cấu trúc dự kiến.
4.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
4.2.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các acid hydroxamic mang khung benzothiazol
 4.2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các acid hydroxamic mang vòng phenyl
 4.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của acid hydroxamic mang vòng
thiazol
 4.3. Hoạt tính sinh học.
4.3.1. Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol.
4.3.2. Các acid hydroxamic mạch alkyl có liên kết amid.
4.3.3. Docking.
4.3.4. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

(ppm) Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) 13C - NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C - Nuclear Magnetic Resonance)
1H - NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - Nuclear Magnetic Resonance)
AcOH Acid acetic ADN Acid desoxyribonucleic
AsPC - 1 Dòng tế bào ung thư tụy người
BCL2 B - cell lymphoma 2
CBFb Core - binding factor subunit beta
CBP Cyclic - AMP response element - binding protein
CDI Carbonyl diimidazol
CTPT Công thức phân tử
DCC Dicyclohexyl carbodiimid
DCM Dicloromethan
DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium
DMF Dimethylformamid
DMSO - d6 Dimethylsulfoxid deutri hóa
ESI Ion hóa phun bụi điện tử (Electron Spray Ionization)
FBS Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)
FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm mỹ
HAT Histon acetyltransferase
HATU N - [(dimethylamino) - 1H - 1,2,3 - triazol [4,5 - b] pyridin - 1ylmethylen] - N -
methylmethanaminium hexafluorophosphat
HDAC Histon deacetylase
HDIs Các chất ức chế HDAC
HDLP Histone deacetylase - like protein
HMBC Phổ tương tác đa liên kết dị nhân
HOBt 1 - hydroxybenzotriazol
HSQC Phổ tương tác dị nhân qua một liên kết
IC50 Nồng độ ức chế 50%
IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectrometry)
i Dịch chuyển điện tích
J Hằng số tương tác (Hz)
MCF - 7 Tế bào ung thư vú người
MeOH Methanol
MOZ Monocytic leukemia zinc - finger protein
MS Phổ khối lượng (Mass Spectrometry)
MTT 3 - (4,5 - dimethylthiazol - 2 - yl) - 2,5 - diphenyltetrazolium bromid
NCI - H460 Tế bào ung thư phổi người
PBS Đệm phosphat (Phosphat buffered saline)
PC - 3 Tế bào ung thư tiền liệt tuyến người
PCl3 Phosphor triclorid
PCl5 Phosphor pentaclorid
POCl3 Phosphor oxyclorid
PVDF Màng polyvinyliden difluorid
rH Dịch chuyển hydro
αRAR Receptor acid retinoic
ROS Reactive oxygen species
RPMI Môi trường nuôi cấy tế bào
SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic
SDS - PAGE Gel SDS - PAGE (Sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gel
electrophoresis)
Sin 3 Protein ức chế phiên mã
SMMHC Tế bào cơ (Smooth muscle myosin heavy chain)
SW620 Tế bào ung thư đại tràng người
TSA Trichostatin A
t ^oC Nhiệt độ nóng chảy
WAF1 Chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin
ZBG Nhóm gắn ion Zn2 +

Danh mục bảng biểu

 Bảng 1.1 Phân loại các chất ức chế HDAC 13.
Bảng 1.2 Các chất ức chế HDAC đã và đang được thử lâm sàng 19.
Bảng 1.3 Tác dụng ức chế HDAC2 và độc tính tế bào của dẫn chất W - alkoxy (AH10).
Bảng 3.1 Kết quả phân tích phổ khối của các chất 3a - f,5a - f 6.
Bảng 3.2 Kết quả phân tích phổ 1 H - NMR của các chất 3a - f,5a - f 6.
Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ 13 C - NMR của các chất 5a - f 6.
Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối của các chất 7a - f,9a - h 7.
Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1 H - NMR của các chất 7a - f,9a - h 7.
Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 13 C - NMR của các chất 7a - f,9a - h 7.
Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ khối của các chất 11a - d,13a - f 8.
Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ 1 H - NMR của các chất 11a - d,13a - f 8.
Bảng 3.9 Kết quả phân tích phổ 13 C - NMR của các chất 11a - d,13a - f 8.
Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ khối của các chất 17a - c, f, h,20a - h 9.
Bảng 3.11 Kết quả phân tích phổ 1 H - NMR của các chất 17a - c, f, h,20a - h.
Bảng 3.12 Kết quả phân tích phổ 13 C - NMR của các chất 17a - c, f, h,20a - h.
Bảng 3.13 Tóm tắt kết quả tổng hợp các dẫn chất trong luận án 98.
Bảng 3.14 Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp 10.
Bảng 3.15 Kết quả định lượng tác dụng ức chế HDAC2 của các chất
9a - h,23.
Bảng 3.16 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro 1.
Bảng 3.17 Sự thay đổi kích thước và khối lượng của khối u trên chuột ở nhóm thử, nhóm trắng đối chiếu và SAHA.
Bảng 3.18 Phần trăm thay đổi cân nặng của chuột trong quá trình thí nghiệm.
Bảng 4.1 Cường độ cụm pic ion phân tử của chất 7a
Bảng 4.2 Dữ liệu các phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất 9g
Bảng 4.3 Dữ liệu phổ 1 H - NMR và 13 C - NMR của chất 23
Bảng 4.4 Tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào in vitro của các chất 7a - f
Bảng 4.5 Tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào in vitro của các chất 9a - h
Bảng 4.6 Năng lượng liên kết với trung tâm hoạt động của HDAC
Bảng 4.7 Kết quả ức chế sự phát triển khối u in vivo của chất 9g ở các liều khác nhau với dòng tế bào ung thư PC - 3

 HISTON DEACETYLASE   

Các nghiên cứu về ung thư đã xác định căn nguyên của bệnh không chỉ do cơ  chế di truyền học mà còn do cơ chế di truyền biểu hiện gen. Cơ chế di truyền biểu hiện  gen liên quan đến những thay đổi trong quá trình biểu hiện gen mà không ảnh hưởng  đến cấu trúc chuỗi ADN. Cơ chế di truyền biểu hiện gen gồm các biến đổi về ADN và  histon như sự methyl hóa, acetyl hóa [25,55,71,90]. Những biến đổi này dẫn đến các  bất thường của quá trình biểu hiện gen thể hiện ở sự phát triển, sự biệt hóa và sự chết  tế bào theo chương trình, kết quả là tăng khả năng biến đổi của tế bào.

 Cho đến nay, các nghiên cứu đã chứng minh cấu trúc của nhiễm sắc thể là yếu  tố quan trọng trong điều hòa quá trình biểu hiện gen [11,22,63,71]. Cấu trúc của nhiễm  sắc thể là một phức hợp cấu tạo bởi ADN, các histon và các protein không phải histon  [22,40]. Histon là các protein cơ bản giàu acid amin như lysin, arginin, được chia  thành 5 nhóm chính (H1, H2A, H2B, H3, H4). Từng cặp của H2A, H2B và H3, H4  cùng nhau tạo nên lõi protein octomer hình đĩa. Lõi protein này được quấn quanh bởi 146 cặp ADN tạo nên nucleosom (hình 1.1) [11,22,63,71,77]. Các nucleosom nối với  nhau nhờ phần amino tận của các histon. Bốn cặp histon lõi có 2 phần quan trọng:

Phần đuôi C nằm bên trong lõi của nucleosom và phần đầu N với acid amin kết thúc là  lysin nằm bên ngoài nucleosom [63]. Cấu trúc này chịu ảnh hưởng chính bởi sự biến  đổi phần đầu N của histon. Phần đầu N của histon, đặc biệt H3, H4 là nơi diễn ra rất  nhiều quá trình biến đổi khác nhau trong phiên mã như acetyl hóa/deacetyl hóa lysin,  methyl hóa lysin và arginin, phosphoryl hóa serin và ubiquinin, sumoyl hóa lysin  [22,40,71].

 Cơ chế của phần lớn các biến đổi trên đều chưa sáng tỏ. So với sự methyl hóa  và phosphoryl hóa, dường như sự acetyl hóa phần lõi histon là quá trình biến đổi đã  được nghiên cứu và hiểu biết tường tận hơn. Histon có thể tồn tại ở một trong hai dạng  đối lập nhau là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa. Các enzym đóng vai trò trong sự chuyển  đổi này là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC)  [11,22,40,63,71]. Khi xảy ra sự acetyl hóa histon, nhiễm sắc thể sẽ được tháo xoắn và  hoạt hóa quá trình phiên mã, trong khi đó deacetyl hóa phần đầu N của histon sẽ làm  giảm quá trình phiên mã thông qua sự đóng xoắn nhiễm sắc thể. Nói chung, khi tăng  acetyl histon dẫn đến thúc đẩy quá trình phiên mã và ngược lại khi sự acetyl hóa histon  giảm làm ngăn cản quá trình phiên mã (hình 1.2) [63,71].     Histon acetyltransferase (HAT) xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym

a. đến liên kết với nhóm -amino của lysin ở phần đầu N của histon. Sự chuyển đổi  này xảy ra nhiều hơn trên histon H3, H4. Vị trí acetyl hóa quan trọng là Lys9  và Lys14   trên histon H3; Lys5 , Lys8 , Lys12  và Lys16  trên histon H4 [71,77]. Sự acetyl hóa histon  làm tháo xoắn nhiễm sắc thể bằng cách trung hòa điện tích dương của phần đầu N của  histon, do vậy làm giảm ái lực của histon với phần tích điện âm trên ADN [70]. Chính  vì vậy, việc tăng acetyl hóa histon làm nới lỏng cấu trúc nhiễm sắc thể và hoạt hóa  gen.    Các histon acetyltransferase được chia thành 5 nhóm bao gồm khoảng 20  isoenzym [15,22,40,70]. Cơ sở của việc phân nhóm này là dựa trên sự tương tự nhau  của cấu trúc chuỗi cơ bản và thường có cơ chất đặc hiệu. Nhóm HAT đầu tiên là các  GNAT (Gcn5-related N-acetyltransferase), bao gồm các protein liên quan đến sự bắt  đầu phiên mã, như là Gcn5 và PCAF (p300/cyclic-AMP-response-element binding  protein-associated factor). Nhóm thứ hai là các MYST, được đặt tên theo protein gắn  Zn trong bệnh bạch cầu đơn nhân to (MOZ-monocytic leukemia zinc-finger protein),  YBF2/SAS3, SAS2 và HIV-1 TAT-interactive protein 60 (TIP60). Nhóm thứ ba là 2  enzym liên quan chặt chẽ đến protein p300 và CBP (cyclic-AMP response element- binding protein), chúng hoạt động như chất đồng hoạt hóa một số phức hợp của nhân  tố sao chép mã. Hai nhóm HAT khác là các chất đồng hoạt hóa receptor nhân như  phức hợp TFIID (general transcription factor IID) (cấu trúc dưới phân tử là TAFII250)  và ACTR (amplified in breast cancer), SRC1 (avian sarcoma viral oncogene  homologue 1) [20]. Không chỉ acetyl hóa đuôi histon, các HAT còn có thể acetyl hóa  các chất đồng hoạt hóa, chất đồng ức chế sao chép mã như E2F, p53, GATA1 [40,76].

Như vậy, các HAT đóng vai trò quan trọng trong hoạt hóa cũng như ức chế gen. Các  HAT không gắn kết trực tiếp với ADN mà tạo thành phức hợp với các HAT khác cũng  như với các nhân tố sao chép mã.